Détection et caractérisation moléculaire

Isolement et caractérisation moléculaire des virus par RT-PCR en temps réel et RT-PCR et séquençage.

• Selles – Type d’échantillon requispour la détection du poliovirus, car il est celui dans lequel le poliovirus est le plus susceptible d’être isolé. Pour accroître la probabilité d’isolement du poliovirus, prélevez au moins deux échantillons de selles à 24 heures d’intervalle chez les patients soupçonnés d’être atteints de poliomyélite. Ces échantillons devraient être prélevés idéalement dans les 14 jours suivant l’apparition des symptômes. Volume minimal requis : 1 gramme; 2 ou 3 grammes
• Sérum – Non recommandé, car la probabilité d’obtenir un poliovirus en culture avec ce type d’échantillon est faible.
• LCR – Non recommandé, car ce type d’échantillon permet rarement de détecter un poliovirus.
• Écouvillonnage nasopharyngé ou oropharyngé – Non recommandé, car la probabilité d’obtenir un poliovirus en culture avec ces types d’échantillons est plus faible qu’avec les selles. Cependant, ils peuvent être utiles pour éliminer les causes de paralysie flasque aiguë (PFA) non liées à la poliomyélite.
  

Remarque : Si du LCR, du sérum ou des échantillons respiratoires sont expédiés à des fins de détection du poliovirus, ils ne subiront pas d’épreuve d’isolement du poliovirus; ils feront plutôt l’objet de méthodes moléculaires de détection et de typage des entérovirus et des paréchovirus humains. 

Les échantillons qui ne sont pas expédiés congelés, dont le volume est insuffisant, ou qui ne sont pas accompagnés des renseignements pertinents sur le patient peuvent être rejetés.

• Selles - Prélever dans les 14 jours suivant le début de la maladie et déposer dans un contenant stérile étanche, pas de milieu spécial requis. Les taux d’isolement augmentent lorsqu’on reçoit deux échantillons prélevés à 24 heures d’intervalle.

Entreposez les échantillons aussitôt que possible après le prélèvement à une température = -20 °C jusqu’au moment de leur expédition à des fins d’analyse.  Expédier les échantillons congelés sur glace sèche. Emballer les échantillons de Poliovirus présumé dans un contenant d’expédition séparé des autres échantillons envoyés au LNM.

L’expédition des prélèvements doit être confiée à une personne détenant un certificat de formation TMD, conformément au Règlement sur le TMD. Pour plus d’information sur la catégorisation des matières à des fins d’expédition, veuillez consulter la partie 2 de l’appendice 3 du règlement ou la section 3.6.2 du règlement de l’IATA sur les produits dangereux.

Cas de paralysie flasque aiguë chez les enfants de moins de 15 ans et cas suspects de poliomyélite chez les patients de tout âge.

Remplir le formulaire de requête pour les entérovirus et les virus entériques. Si possible, inclure toute observation clinique pertinente, les antécédents de voyage et de vaccination et tout résultat pertinent d’analyses de laboratoire effectuées au laboratoire local ou provincial.

S/O

La détection et la caractérisation moléculaire des poliovirus font appel à trois protocoles agréés par l’OMS :

• Isolement du virus en culture cellulaire : Le surnageant issu des échantillons de selles traités est inoculé dans deux lignées cellulaires recommandées par l’OMS, les cellules L20B (une lignée de cellules de souris transgéniques exprimant le récepteur du poliovirus humain, CD155) et les cellules RD-A (rhabdomyosarcome humain). Les cultures cellulaires inoculées sont observées au microscope pendant 14 jours pour détecter la présence d’un effet cytopathique, susceptible d’indiquer une infection par un poliovirus (isolats positifs de L20B) ou par un entérovirus non poliomyélitique (isolats positifs de RD-A uniquement). Les isolats positifs de L20B positives font ensuite l’objet d’une caractérisation moléculaire plus poussée, comme il est décrit ci-dessous.
• Différenciation intratypique des poliovirus par PCR en temps réel : Des réactifs moléculaires spécifiques des groupes, des sérotypes et des souches vaccinales de poliovirus et qui ciblent des propriétés caractéristiques des poliovirus dans la région de la capside (VP1) sont utilisés dans une série d’épreuves de RT-PCR en temps réel pour déterminer le sérotype et pour distinguer les poliovirus d’allure vaccinale des poliovirus sauvages et des poliovirus dérivés d’une souche vaccinale (différenciation intratypique). Les isolats qui s’avèrent non apparentés au vaccin, qui sont discordants aux tests de différenciation intratypique et tous les poliovirus de type 2 (PV2) sont envoyés au laboratoire en vue d’un séquençage de la région VP1 pour confirmer s’il s’agit d’un poliovirus Sabin ou de type Sabin, d’un poliovirus dérivé d’une souche vaccinale nOPV2 ou de type nOPV2 ou d’un poliovirus dérivé d’une souche vaccinale (PVDV) ou sauvage.
• Séquençage de la région VP1 des poliovirus : La classification des isolats de poliovirus est confirmée selon le degré de divergence des séquences de la région VP1 complète de l’isolat par rapport aux souches de référence Sabin ou nOPV2 correspondantes - PV1 (AY184219); PV2 (AY184220); PV3 (AY184221); nOPV2 (MZ245455) :
  
  • Type Sabin : < 1 % de divergence (différences < 10 nt) pour les PV de types 1 et 3; < 0,6 % de divergence (différences < 6 nt) pour les PV de type 2.
    
  • Nouveau vaccin antipoliomyélitique oral contre le poliovirus de type 2 (nOPV2) : < 0,6 % de divergence (différences < 6 nt).
    
  • PVDV :  =  1 % de divergence (différence  = 10 nt) pour les PV de types 1 et 3;  = 0,6 % de divergence (différences  = 6 nt) pour les PV de type 2. Lorsqu’il est établi que le nouveau vaccin antipoliomyélitique oral (nOPV) est le vaccin d’origine, le type correspondant « -n » est indiqué dans son acronyme (p. ex. PVDV2-n).
    
  • Poliovirus sauvage (PVS) :  = 15 % de divergence

Au besoin, d’autres tests peuvent être effectués par les CDC d’Atlanta, en Georgie, le laboratoire de référence du Réseau mondial de laboratoires pour la poliomyélite (RMLP) de l’OMS.

29 jours civils pour l'algorithme de test complet.

1. World Health Organization. Polio Laboratory Manual. WHO/IVD/04.10,2004.
2. S1. Supplement to the WHO Polio Laboratory manual-an Alternative Test Algorithm for Poliovirus Isolation and Detection.
3. Kilpatick DR, Iber JC, Chen Q, Ching K, Yang S, De L, Mandelbaum MD, Emery B, Campagnoli R, Burns CC, Kew O. Poliovirus serotype-specific VP1 sequencing primers. J of Virol. Methods 174(2011) 128-130